قبل از آزمایش، تمام معرف ها و نمونه ها باید تا دمای اتاق متعادل شوند. پس از ذوب مجدد، نمونه ها باید دوباره سانتریفیوژ شده و مایع رویی برای آزمایش گرفته شود. برای معرف ها یا آماده سازی نمونه، مخلوط کنید و از ایجاد کف جلوگیری کنید. کالیبراسیون و نمونه ها برای آزمایش های تکراری توصیه می شود.

1. اضافه کردن ple: محلول کار استاندارد را به نوبه خود به دو چاه اول اضافه کنید و برای هر غلظت محلول کار دو سوراخ اضافه کنید، 100 μ L از هر چاه نمونه های مورد آزمایش به چاه های دیگر اضافه می شوند، 100 μ L در هر چاهک (برای غلظت نمونه بالاتر از محدوده آزمایش، نمونه با رقت استاندارد و نمونه رقیق شده است). میکروپلیت با فیلم پوشش داده شد و در دمای 37 انکوبه شد ℃ به مدت 90 دقیقه نکته: هنگام اضافه کردن نمونه به کف میکروپلیت، سعی کنید دیواره سوراخ را لمس نکنید، به آرامی تکان دهید و مخلوط کنید تا از ایجاد حباب جلوگیری شود. زمان اضافی باید در عرض 10 دقیقه کنترل شود.

2. آنتی بادی/آنتی ژن بیوتینیله: مایع را دور بریزید و خشک کنید، بدون شستن. 100 میکرولیتر محلول عامل آنتی بادی/آنتی ژن بیوتینیله بلافاصله به هر چاهک اضافه شد، مخلوط شد، میکروپلیت به اضافه فیلم پوشش داده شد و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت انکوبه شد.

3. شستشو: مایع را در سوراخ تکان دهید، 350 میکرو لیتر مایع شستشو را به هر چاه اضافه کنید، 1-2 دقیقه خیس کنید، مایع را در میکروپلیت بمکید یا تکان دهید و روی کاغذ جاذب ضخیم خشک کنید. این مرحله بشقاب شستشو را 3 بار تکرار کنید. نکته: ماشین لباسشویی را می توان در اینجا و در سایر مراحل شستشو استفاده کرد. هر مرحله از شستشو برای آزمایش ضروری است.

4. مزدوج آنزیم HRP: 100 μ L محلول کاری مزدوج آنزیمی در هر چاهک، مخلوط شده، با فیلم پوشانده شده و در دمای 37 انکوبه می شود. ℃ به مدت 30 دقیقه

5. شستشو: مایع را در چاه بریزید و بشقاب را 5 بار به روش مرحله 3 بشویید.

6. بستر: 90 میکرولیتر محلول بستر (TMB) را به هر چاهک اضافه کنید، خوب مخلوط کنید، پوشش فیلم اضافه کنید و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت حدود 15 دقیقه انکوبه کنید. توجه: زمان جوجه کشی باید با توجه به وضعیت واقعی رشد رنگ کوتاه یا طولانی شود، اما نه بیش از 30 دقیقه. هنگامی که یک گرادیان واضح در سوراخ استاندارد ظاهر می شود، می توان آن را خاتمه داد.

7. خاتمه: 50 اضافه کنید μ L محلول پایان به هر چاه برای خاتمه واکنش. توجه: ترتیب جمع محلول پایانی باید مانند محلول بستر باشد.

8. بخوانید: فوراً چگالی نوری (OD) هر چاهک را در 450 نانومتر با یک میکروپلیت خوان اندازه گیری کنید. میکروپلیت خوان باید از قبل باز شود تا روش تست تنظیم شود.

9. پس از انجام آزمایش، معرف استفاده نشده را با توجه به دمای مشخص شده تا زمان ماندگاری در یخچال قرار دهید.